Наукові новини: Створено прототип клітини, здатний синтезувати компоненти власної мембрани
Для вирішення багатьох біотехнологічних завдань вже давно й успішно використовують живі клітини. Але клітина – дуже складна система. Її поведінка залежить від зовнішніх умов, тому вона не завжди підпорядковується інструкціям вчених, які намагаються перетворити клітину, наприклад, на фабрику з виробництва ліків. Тому біотехнологи намагаються розробити штучні аналоги клітин, які містять мінімально можливий набір генів і служать для досягнення конкретної мети. Учені з Нідерландів зробили важливий крок до вирішення цього завдання: вони створили прототип клітини, що синтезує ліпіди, з яких складається його мембрана.
Рис. 1. Штучна клітина – синтетична біополімерна капсула, в яку укладені молекули, що виконують певні функції. Мінімальний набір компонентів штучної клітини включає в себе клітинну мембрану, молекули-носії інформації (ДНК або РНК) і систему, що дозволяє клітині синтезувати білки. Хоча повноцінні штучні клітини ще не створені, вчені активно працюють у цьому напрямку.
Термін «біотехнологія» виник тільки в XX столітті, але можна вважати, що розвиток цієї науки почавя ще в давнину, коли люди вперше почали готувати хліб, вино, сир та інші продукти, в яких використовуються мікроорганізми. Справжній прорив у розвитку біотехнологій стався в 70-х роках XX століття, коли вчені навчилися безпосередньо змінювати ДНК живих організмів. З тих пір генетично модифіковані клітини бактерій, рослин і тварин знайшли багато корисних застосувань. Як вдалі приклади можна згадати організми, які синтезують ліки та біопаливо. Так, бактерія Escherichia coli, «запрограмована» на синтез інсуліну, допомогла налагодити широке промислове виробництво цього гормону, забезпечивши хворих на діабет необхідними ліками за доступною ціною (DV Goeddel et al., 1979.). А ацетогенні бактерії (мікроорганізми, які виділяють ацетат в процесі анаеробного дихання) були пристосовані для виробництва етанолу, ацетону та бутанолу, що використовуються в якості компонентів палива (F. Liew et al., 2016).
Але не всі спроби перетворити клітини в живі фабрики або адаптувати їх для інших застосувань виявилися такими успішними. Річ у тому, що крім виконання генетичної програми, яку вчені додавали в клітину (наприклад, інструкцію «синтезує інсулін!»), вона одночасно виконує сотні інших вказівок від власного генетичного апарату («розмножуватися!», «шукай їжу!», «захищайся від небезпеки!»). Ці паралельні процеси можуть перешкодити їй робити те, що потрібно вченим. Більш того, протягом свого життя клітина може мутувати або несподіваним чином змінювати наші інструкції. А для застосування таких клітинних машин, наприклад, в медицині, потрібна висока надійність і гарантія від усіляких несподіванок.
Альтернатива використання живих клітин – створення спрощених їх аналогів, які замість повного генома містять тільки невелику колекцію необхідних генів. Одним з перших прикладів такого підходу стали безклітинні системи (Cell-free system). Вони являють собою екстракти, що містять все необхідне для синтезу білка: рибосоми, полімерази та інші складові транскрипції і трансляції (Y. Lu, 2017). Компоненти безклітинних систем можуть зберігатися в розчині або в ліофілізованому (замороженому і висушеному) вигляді. Якщо змішати розчини в певних пропорціях або додати воду до висушеним компонентів, а потім додати ДНК, то очищені білки візьмуться за виконання закодованих в генах інструкцій.
Безклітинні системи часто використовують для вивчення регуляції активності генів, синтезу модифікованих білків і для створення біосенсорів – біологічних систем, які можуть, наприклад, виявити токсичні речовини в воді або вимірювати рівень певних мікроелементів в зразку крові (A. Tinafar et al., 2019). Проте недолік безклітинних систем в тому, що вони не можуть самостійно рости та розмножуватися й не мають бар'єра, що відокремлює і захищає їх від зовнішнього середовища. Це означає, що безклітинні системи складно використовувати поза лабораторією: на відміну від живих клітин, вони не можуть регенеруватися і швидко виходять з ладу в несприятливих умовах.
Щоб зробити безклітинну систему більш схожою на клітину, можна оточити її мембраною. Клітинна мембрана складається з білків і ліпідів – молекул, які не розчиняються у воді, а групуються разом, утворюючи подвійний шар, який захищає вміст клітини від зовнішнього середовища. Деяким дослідникам вже вдалося створити мембранні капсули, що містять безклітинні системи. В одній із перших робіт по цій темі вченим з Прінстонського університету вдалося укласти в оболонку з ліпідів компоненти для виробництва зеленого флуоресцентного білка (V. Noireaux, A. Libchaber, 2004). В іншому дослідженні були створені ліпідні капсули, що містять гени для виробництва білків, здатних знищувати ракові клітини (N. Krinsky et al., 2018). Ці результати можуть мати цікаві застосування – наприклад, такі капсули можна ввести в ділянку пухлини, щоб вони локально виробляли ліки. Але як зробити так, щоб штучні клітини могли регенерувати – збільшуватися в об'ємі, а згодом і ділитися, створюючи свої копії? На це питання спробували відповісти дослідники з Делфтського технічного університету в Нідерландах (Duco Blanken, David Foschepoth, Adriana Calaça Serrão & Christophe Danelon).
Автори статті, опублікованої нещодавно в журналі Nature Communications, вирішили створити штучну клітину, яка вміє синтезувати два види ліпідів, які часто зустрічаються в мембранах бактерій: фосфатидилетаноламін і фосфатидилгліцерол. В якості вихідних компонентів для синтезу ліпідів вони використовували молекули гліцераль-3-фосфат і ацетил-КоА.
Перетворення вихідних компонентів синтезу в фосфоліпіди відбувається в кілька етапів. За кожен з них відповідає спеціальний фермент. Дослідники створили міні-геном з генами, необхідними для виробництва цих ферментів (рис. 2).
Рис. 2. Синтез фосфоліпідів за допомогою ферментів, закодованих в міні-геномі штучної клітини. Міні-геном містить сім генів, необхідних для синтезу фосфатидилетаноаміну (PG) і фосфатидилгліцеролу (PE). Ферменти вбудовуються в мембрану ліпосоми, де і відбувається синтез нових ліпідів. Основні продукти реакцій виділені жирним шрифтом, а назви ферментів виділені кольором. Ферменти, що беруть участь в реакції: гліцерин-3-фосфат-ацилтрансфераза (PlsB), лізофосфатидна кислота-ацилтрансфераза (PlsC), інтегральний мембранний білок CdsA, CDP-диацилгліцерол-гліцерин-3-фосфат-3-фосфатидил трансфераза (PgsA), фосфатидилгліцерол фосфатази A, B, C (PgpA, PgpB, PgpC).
У суміш, яка містить копії генома, додали компоненти безклітинної системи і заздалегідь підготовлені ліпіди. Вони формують ліпідні бульбашки (ліпосоми) – каркаси, до яких будуть приєднуватися нові ліпіди, створені ферментами. У результаті в суміші утворилися ліпідні бульбашки, що містять міні-геном і все необхідне для експресії генів (рис. 3). Варто відзначити, що копії геному випадково розподіляються в розчині. Частина з них виявляється всередині бульбашок, а частина – назовні. Але так як бульбашки займають значну частину обсягу розчину, багато які з них виявляються начиненими усіма потрібними компонентами.
Рис. 3. Схема експерименту із створення штучних клітин, які синтезують ліпіди-компоненти мембран. У суміш додають копії генома, ліпіди, компоненти безклітинної системи і вихідні молекули для синтезу ліпідів. У результаті утворюються ліпосоми, що містять ферменти, які виробляють нові ліпіди (сині). Через випадковий розподіл компонентів частина реакцій може проходити поза ліпосомами.
Щоб перевірити, чи працює їхня ідея, автори замінили один з атомів вуглецю у вихідних молекулах на важчий ізотоп цього елементу. Це допомогло відрізнити нові ліпіди від уже присутніх в ліпосомних каркасах. Потім вони застосували метод мас-спектрометрії, що дозволяє ідентифікувати молекули на основі інформації про їх масу та заряд. Результати цього експерименту показали, що в суміші дійсно утворилися нові ліпіди.
Але питання про ефективність штучних клітин залишалося відкритим. В описаному вище експерименті вимірювали загальний рівень нових ліпідів у суміші і не враховували, яка частка всіх реакцій відбувалася всередині ліпосом, а яка – поза ними. Після того як ліпосоми сформувалися, автори додали до суміші ферменти протеазу і ДНКазу, які руйнують білки і ДНК, не захищені ліпосомами. Це допомагає уникнути синтезу ліпідів поза ліпосомами
Для підтвердження того, що білки тепер знаходяться тільки всередині штучних клітин, дослідники позначили їх мембрани червоним флуоресцентним білком і додали ДНК жовтого флуоресцентного білка (рис. 4). Як і копії міні-генома, ці ДНК випадково розподілялися в суміші. Жовтий сигнал вказував на ділянки локалізації білка, допомагаючи впевнитися, що білки поза ліпосомами були знищені. Вимірювання концентрації нових ліпідів, зроблені виключно в ліпосомах, показали, що синтез має високу ефективність: 40 % вихідних продуктів були успішно перетворені в ліпіди.
Рис. 4. Зображення ліпосом, отримане за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Мембрани ліпосом позначені червоним флуоресцентним білком (вони виглядають як фіолетові кільця). До реакції була додана ДНК жовтого флуоресцентного білка. Без додавання протеази і ДНКази експресія генів відбувається як всередині, так і поза ліпосомами (ліворуч). За наявності протеази (в центрі) або ДНКази (праворуч) експресія генів локалізується всередині ліпосом. Малюнок з обговорюваної статті в Nature Communications.
На наступному етапі автори спробували відповісти на кілька важливих питань: який відсоток ліпосом виробляє нові ліпіди? Як швидко відбувається синтез? Наскільки ліпосоми відрізняються одна від одної? Щоб простежити за синтезом нових ліпідів, дослідники використовували зелений флуоресцентний білок. З його допомогою вони створили маркер, який прикріплювався до мембрани ліпосом у тому місці, де з'являвся новий ліпид (рис. 5). У міру синтезу нових ліпідів мембрани ліпосом починали флуоресціювати зеленим.
Рис. 5. Виявлення ліпосом, які синтезують нові ліпіди. Флуоресцентна мітка прикріплюється до мембрани в тому місці, куди умонтувалися нові ліпіди. У міру їх синтезу яскравість флуоресценції збільшується, дозволяючи виявити «активні» ліпосоми.
Автори простежили, як флуоресценція окремих ліпосом змінюється з часом. Вони помітили, що яскравість поступово збільшується і досягає свого максимуму після 16 годин (рис. 6, ліворуч). Але виявилося, що тільки близько половини ліпосом виробляли нові ліпіди (рис. 6, праворуч). Це відбувається тому, що компоненти, потрібні для синтезу, не потрапили до деяких ліпосом. Хоча 50 % – хороший результат для першої спроби, в подальшому автори сподіваються підвищити ефективність своєї технології.
Рис. 6. Ліворуч – динаміка синтезу фосфоліпідів і приєднання флуоресцентної мітки. Спостереження за допомогою флуоресцентної мікроскопії дозволяють простежити за синтезом ліпідів в реальному часі. Флуоресцентна мітка прикріплюється до мембрани в тому місці, куди умонтувалися нові ліпіди. Збільшення яскравості зеленого флуоресцентного білка відповідає збільшенню концентрації нових ліпідів в мембрані. Праворуч – розподіл ліпосом, які виробляють нові ліпіди. Аналіз повного зображення дозволяє визначити відсоток ліпосом, які синтезують нові ліпіди.
На наступному етапі дослідникам потрібно буде знайти спосіб створення штучної клітини, яка вміє значно збільшуватися в об'ємі і ділитися. Для цього вони пропонують поліпшити безклітинну систему та збільшити концентрацію ферментів, які виробляють ліпіди. А коли клітина досягне потрібного обсягу, розподіл відбудеться автоматично (такий рідкісний механізм розподілу є у деяких бактерій, див. R. Mercier et al., 2013). Цей процес можна буде регулювати за допомогою температурних коливань, які провокують деформацію мембрани.
Результати, описані в обговорюваній статті, – важливий крок в роботі над створенням повноцінної штучної клітини. Вони показують, що весь ланцюжок реакцій, потрібних для синтезу мембранних ліпідів, можна помістити всередину ліпосом. Крім того, дизайн штучної клітини, створений авторами, можна використовувати як платформу для виробництва різних типів ліпідів, корисних в фармацевтиці та промисловості: компонентів мазей, емульсій, покриттів і фарб.
Можна сподіватися, що успіхи у створенні штучних клітин в майбутньому допоможуть побудувати надійні біореактори для дешевого виробництва складних хімічних сполук. Штучні клітини можуть послужити основою для біосенсорів, які працюють в умовах, несумісних з виживанням звичайних клітин, а також будуть корисні для створення нових методів лікування і діагностики захворювань – наприклад, в якості інструменту для місцевого синтезу і цільової доставки ліків. Це, на нашу думку, цілком стосується і ветеринарної медицини.
Джерела: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
Підготував проф. Віктор Трокоз
