Нобелівська премія з хімії 2017
Нобелівська премія з хімії 2017
26 December 2024, 11:01
Жак Дюбоше, Йоахім Франк і Річард Хендерсон отримали Нобелівську премію з хімії 2017 року за розробку ефективного методу створення тривимірних зображень молекул життя. Використовуючи кріоелектронну мікроскопію, дослідники тепер можуть заморозити біомолекули в середині руху та зобразити їх в атомарній роздільній здатності. Ця технологія перенесла біохімію в нову еру.
Вони зобразили життя в атомних деталях
За останні кілька років численні дивовижні структури молекулярного механізму життя заполонили наукову літературу (рис. 1): ін’єкційна голка сальмонели для атаки на клітини; білки, які надають стійкість до хіміотерапії та антибіотиків; молекулярні комплекси, які керують циркадними ритмами; світловловлюючі реакційні комплекси для фотосинтезу та датчик тиску типу, який дозволяє нам чути. Це лише кілька прикладів із сотень біомолекул, які тепер були зображені за допомогою кріоелектронної мікроскопії (кріо-ЕМ).
Коли дослідники почали підозрювати, що вірус Зіка спричиняє епідемію новонароджених із ураженням мозку в Бразилії, вони звернулися до кріо-ЕМ, щоб візуалізувати вірус. Протягом кількох місяців були створені тривимірні (3D) зображення вірусу з атомною роздільною здатністю, і дослідники могли почати пошук потенційних мішеней для фармацевтичних препаратів.
Рисунок 1. За останні кілька років дослідники опублікували атомні структури численних складних білкових комплексів. a. Білковий комплекс, який регулює добовий ритм. b. Датчик такого типу, який зчитує зміни тиску у вусі та дозволяє нам чути. в. Вірус Зіка.
Жак Дюбоше, Йоахім Франк і Річард Хендерсон зробили новаторські відкриття, які дозволили розробити кріо-ЕМ. Цей метод переніс біохімію в нову еру, зробивши знімки біомолекул легшими, ніж будь-коли раніше.
Картинки – важливий ключ до знань
У першій половині двадцятого століття біомолекули – білки, ДНК і РНК – були terra incognita на карті біохімії. Вчені знали, що вони відіграють фундаментальну роль у клітині, але не мали уявлення, як вони виглядають. Лише в 1950-х роках, коли дослідники в Кембриджі почали піддавати кристали білків рентгенівським променям, вперше вдалося візуалізувати їх хвилеподібні та спіралеподібні структури.
На початку 1980-х років використання рентгенівської кристалографії було доповнено використанням спектроскопії ядерного магнітного резонансу (ЯМР) для вивчення білків у твердому стані та розчині. Цей метод не тільки розкриває їхню структуру, але й те, як вони рухаються та взаємодіють з іншими молекулами.
Завдяки цим двом методам тепер існують бази даних, що містять тисячі моделей біомолекул, які використовуються у всьому, від фундаментальних досліджень до фармацевтичних розробок. Однак обидва методи мають фундаментальні обмеження. ЯМР у розчині працює лише для відносно невеликих білків. Рентгенівська кристалографія вимагає, щоб молекули утворювали добре організовані кристали, наприклад, коли вода замерзає до льоду. Зображення схожі на чорно-білі портрети з перших фотоапаратів – їхня жорстка поза розкриває дуже мало про динаміку білка.
Крім того, багато молекул не можуть організувати себе в кристали, що змусило Річарда Хендерсона відмовитися від рентгенівської кристалографії в 1970-х роках – і саме тут починається історія Нобелівської премії з хімії 2017 року.
Проблеми з кристалами змусили Хендерсона змінити шлях
Річард Хендерсон отримав ступінь доктора філософії в бастіоні рентгенівської кристалографії в Кембриджі, Великобританія. Він використовував цей метод для візуалізації білків, але невдачі виникли, коли він спробував кристалізувати білок, який природним чином вбудований в мембрану, що оточує клітину.
Мембранними білками важко керувати. Коли їх вилучають із природного середовища – мембрани – вони часто збираються в непотрібну масу. Перший мембранний білок, з яким працював Річард Хендерсон, було важко виробляти в достатній кількості; другий не зміг кристалізуватися. Після багатьох років розчарування він звернувся до єдиної доступної альтернативи: електронного мікроскопа.
Відкрито для дискусії, чи справді електронна мікроскопія була можливістю в цей час. Просвічуюча електронна мікроскопія, як називається ця техніка, працює більш-менш як звичайна мікроскопія, але замість світла через зразок пропускається пучок електронів. Довжина хвилі електронів набагато коротша за хвилю світла, тому за допомогою електронного мікроскопа можна побачити дуже маленькі структури – навіть положення окремих атомів.
Таким чином, теоретично роздільна здатність електронного мікроскопа була більш ніж достатньою для того, щоб Хендерсон міг отримати атомну структуру мембранного білка, але на практиці цей проект був майже неможливим. Коли в 1930-х роках був винайдений електронний мікроскоп, вчені вважали, що він підходить лише для вивчення мертвої речовини. Інтенсивний електронний промінь, необхідний для отримання зображень високої роздільної здатності, спалює біологічний матеріал, і, якщо промінь ослаблений, зображення втрачає контраст і стає нечітким.
Крім того, для електронної мікроскопії потрібен вакуум — умова, за якої біомолекули псуються, оскільки навколишня вода випаровується. Коли біомолекули висихають, вони руйнуються і втрачають свою природну структуру, роблячи зображення марними.
Майже все вказувало на те, що Річард Хендерсон зазнає невдачі, але проект врятував особливий білок, який він вибрав для дослідження: бактеріородопсин.
Найкращий наразі був недостатнім для Хендерсона
Бактеріородопсин — білок фіолетового кольору, вбудований у мембрану фотосинтезуючого організму, де він вловлює енергію сонячних променів. Замість видалення чутливого білка з мембрани, як раніше намагався зробити Річард Хендерсон, він і його колега взяли повну фіолетову мембрану і помістили її під електронний мікроскоп. Коли білок залишався оточеним мембраною, він зберігав свою структуру; вони покривали поверхню зразка розчином глюкози, що захищало його від висихання у вакуумі.
Жорсткий електронний промінь був серйозною проблемою, але дослідники використовували те, як молекули бактеріородопсину упаковані в мембрані організму. Замість того, щоб підірвати його повною дозою електронів, вони мали слабший потік пучка через зразок. Контраст зображення був поганим, і вони не могли побачити окремі молекули, але вони використовували той факт, що білки були регулярно упаковані та орієнтовані в одному напрямку. Коли всі білки дифрагували електронні промені майже однаковим чином, вони змогли розрахувати більш детальне зображення на основі дифракційної картини – вони використали математичний підхід, подібний до того, який використовується в рентгенівській кристалографії.
На наступному етапі дослідники повернули мембрану під електронним мікроскопом, зробивши знімки з багатьох різних ракурсів. Таким чином у 1975 році вдалося створити приблизну 3D-модель структури бактеріородопсину (рис. 2), яка показувала, як білковий ланцюг сім разів переміщався через мембрану.
Рисунок 2. Перша груба модель бактеріородопсину, опублікована в 1975 році.
Це було найкраще зображення білка, яке коли-небудь було отримано за допомогою електронного мікроскопа. Багатьох людей вразила роздільна здатність, яка становила 7 ангстрем (0,0000007 міліметрів), але Річарду Хендерсону цього було недостатньо. Його метою було досягти такої ж роздільної здатності, яку забезпечує рентгенівська кристалографія, приблизно 3 Ангстрема, і він був переконаний, що електронна мікроскопія може дати більше.
Хендерсон створив перше зображення з атомною роздільною здатністю
Протягом наступних років електронна мікроскопія поступово вдосконалювалася. Лінзи вдосконалювалися, розвивалася кріотехнологія (ми ще повернемося до цього), при якій під час вимірювань зразки охолоджувалися рідким азотом, захищаючи їх від пошкодження електронним променем.
Річард Хендерсон поступово додавав більше деталей до моделі бактеріородопсину. Щоб отримати найчіткіші зображення, він подорожував до найкращих електронних мікроскопів у світі. Усі вони мали свої недоліки, але доповнювали одна одну. Нарешті, в 1990 році, через 15 років після того, як він опублікував першу модель, Хендерсон досяг своєї мети і зміг представити структуру бактеріородопсину в атомарному дозволі (рис. 3).
Рисунок 3. У 1990 році Хендерсон представив структуру бактеріородопсину в атомарному розділенні.
Таким чином він довів, що кріо-ЕМ може надати зображення, настільки ж детальні, як ті, які були отримані за допомогою рентгенівської кристалографії, що стало вирішальною віхою. Однак цей прогрес був побудований на винятку: як білок природним чином регулярно упаковував себе в мембрану. Небагато інших білків спонтанно впорядковують себе таким чином. Питання полягало в тому, чи можна узагальнити метод: би
Чи можливо використовувати електронний мікроскоп для створення 3D-зображень високої роздільної здатності білків, які були випадково розкидані у зразку та орієнтовані в різних напрямках? Річард Хендерсон вірив, що це буде, тоді як інші вважали, що це утопія.
По інший бік Атлантики, в Департаменті охорони здоров’я штату Нью-Йорк, Йоахім Франк довго працював над пошуком вирішення саме цієї проблеми. У 1975 році він представив теоретичну стратегію, згідно з якою очевидно мінімальна інформація, знайдена в двовимірних зображеннях електронного мікроскопа, може бути об’єднана для створення тривимірного цілого з високою роздільною здатністю. На реалізацію цієї ідеї йому знадобилося більше десяти років.
Френк вдосконалює аналіз зображень
Стратегія Йоахіма Франка (рис. 4) заснована на тому, що комп’ютер розрізняє сліди випадково розташованих білків та їх фон на нечіткому зображенні електронного мікроскопа. Він розробив математичний метод, який дозволив комп’ютеру ідентифікувати різні повторювані візерунки на зображенні. Потім комп’ютер відсортував схожі візерунки в одну групу та об’єднав інформацію в цих зображеннях, щоб створити усереднене, чіткіше зображення. Таким чином він отримав кілька двовимірних зображень з високою роздільною здатністю, які показували той самий білок, але під різними кутами. Алгоритми для програмного забезпечення були завершені в 1981 році.
Наступним кроком було математично визначити, як різні двовимірні зображення пов’язані одне з одним, і на основі цього створити тривимірне зображення. Френк опублікував цю частину методу аналізу зображень у середині 1980-х років і використав її для створення моделі поверхні рибосоми, гігантського молекулярного механізму, який будує білки всередині клітини.
Метод обробки зображень Йоахіма Франка був фундаментальним для розробки кріо-ЕМ. Тепер ми перенесемося на кілька років назад у часі – у 1978 році, у той самий час, коли Френк вдосконалював свої комп’ютерні програми, Жака Дюбоше залучили до Європейської лабораторії молекулярної біології в Гейдельберзі, щоб вирішити ще одну з основних проблем електронного мікроскопа: як біологічні зразки висихають і пошкоджуються під час дії вакууму.
Дубочет робить скло з води
У 1975 році Хендерсон використав розчин глюкози, щоб захистити свою мембрану від зневоднення, але цей метод не спрацював для водорозчинних біомолекул. Інші дослідники намагалися заморозити зразки, оскільки лід випаровується повільніше, ніж вода, але кристали льоду настільки порушували електронні промені, що зображення були марними.
Вода, що випаровується, була головною дилемою. Однак Жак Дюбоше побачив потенційне рішення: охолодити воду настільки швидко, щоб вона затверділа в рідкій формі, утворюючи скло замість кристалів. Скло здається твердим матеріалом, але насправді є рідиною, оскільки містить невпорядковані молекули.
Дюбоше зрозумів, що якби він зміг змусити воду утворити скло (також відоме як склоподібна вода), електронний промінь дифрагував би рівномірно та створював однорідний фон.
Спочатку дослідницька група намагалася осклувати крихітні краплі води в рідкому азоті при –196°C, але вдалося лише тоді, коли вони замінили азот етаном, який, у свою чергу, був охолоджений рідким азотом. Під мікроскопом вони побачили краплю, яку вони не бачили раніше. Спочатку вони припустили, що це етан, але коли крапля трохи нагрілася, молекули раптово перегрупувалися й утворили звичну структуру кристала льоду. Це був тріумф, особливо тому, що деякі дослідники стверджували, що неможливо осклувати краплі води. Зараз ми вважаємо, що склоподібна вода є найпоширенішою формою води у Всесвіті.
Проста техніка контрасту
Після прориву в 1982 році дослідницька група Дюбоше швидко розробила основу техніки, яка все ще використовується в кріо-ЕМ (рис. 5). Вони розчинили свої біологічні зразки – спочатку різні форми вірусів – у воді. Потім розчин наносили на тонку металеву сітку у вигляді тонкої плівки. Використовуючи конструкцію, схожу на лук, вони запустили сітку в рідкий етан так, що тонка плівка води склала.
У 1984 році Жак Дюбоше опублікував перші зображення ряду різних вірусів, круглих і шестикутних, які різко контрастують на фоні осклованої води. Тепер біологічний матеріал можна було відносно легко підготувати для електронної мікроскопії, і незабаром дослідники постукали в двері Дюбошета, щоб вивчити нову техніку.
Від блобології до революції
Таким чином, найважливіші частини кріо-ЕМ були на місці, але зображення все ще мали низьку роздільну здатність. У 1991 році, коли Йоахім Франк підготував рибосоми за допомогою методу вітрифікації Дюбоше та проаналізував зображення за допомогою власного програмного забезпечення він отримав 3D-структуру з роздільною здатністю 40 Å. Це був дивовижний крок вперед для електронної мікроскопії, але зображення показало лише контури рибосоми. Чесно кажучи, це виглядало як крапля, і зображення навіть не наближалося до атомної роздільної здатності рентгенівської кристалографії.
Оскільки кріо-ЕМ рідко міг візуалізувати щось, окрім нерівної поверхні, цей метод іноді називали «блобологією». Однак усі гайки й болти електронного мікроскопа поступово були оптимізовані, значною мірою завдяки Річарду Гендерсону, який уперто відстоював своє бачення, що електронна мікроскопія одного дня регулярно забезпечуватиме зображення окремих атомів. Роздільна здатність покращилася, Ångström за Ångström, і остання технічна перешкода була подолана в 2013 році, коли надійшов до використання новий тип детектора електронів (рис. 6).
Малюнок 6. Роздільна здатність електронного мікроскопа радикально покращилася за останні кілька років: від здебільшого показу безформних крапель до тепер можна візуалізувати білки з атомною роздільною здатністю.
Кожен прихований куточок клітини можна досліджувати
Тепер мрія стала реальністю, і ми зіткнулися з вибуховим розвитком біохімії. Існує низка переваг, які роблять кріо-ЕМ настільки революційним: метод вітрифікації Дюбоше відносно простий у використанні та вимагає мінімального розміру зразка. Завдяки швидкому процесу охолодження біомолекули можуть бути заморожені в процесі дії, і дослідники можуть робити серії зображень, які фіксують різні частини процесу. Таким чином вони виробляють «плівки», які показують, як білки рухаються та взаємодіють з іншими молекулами.
Використовуючи кріо-ЕМ, також легше, ніж будь-коли раніше, зобразити мембранні білки, які часто функціонують як мішені для фармацевтичних препаратів, і великі молекулярні комплекси. Проте невеликі білки неможливо вивчити за допомогою електронної мікроскопії, але їх можна візуалізувати за допомогою ЯМР-спектроскопії або рентгенівської кристалографії.
Після того, як у 1975 році Йоахім Франк представив стратегію свого загального методу обробки зображень, дослідник написав: «Якби такі методи були вдосконалені, тоді, за словами одного вченого, небо було б межею».
Тепер ми там – небо є межею. Жак Дюбоше, Йоахім Франк і Річард Хендерсон своїми дослідженнями принесли «людству найбільшу користь». Кожен куточок клітини можна охопити в атомних деталях, і біохімія готова до захоплюючого майбутнього.
